尊龙凯时人胚肺成纤维细胞MRC5培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人胚肺成纤维细胞MRC5

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：MEM+10%FBS+1%NEAA+1%丙酮酸钠+1%L-谷氨酰胺+1%P

传代方法：首次建议1:2传代，传代情况：每2天换液。备注：用无菌离心管收集瓶内培养基，以作过渡对比培养；如对比培养效果不佳，建议直接购买我们的完全培养基。

二、细胞收到后处理

在细胞状态良好时，灌满完全培养液并封好瓶口，为运输细胞提供了最佳保护。收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒。然后，放置于超净工作台内，进行严格的无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，以便于细胞稳定。使用显微镜观察细胞生长并进行不同倍数拍照保存（最佳为40x、100x和200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，若不提供照片则默认为收到状态良好。（建议传代后，一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养，并在换液后将瓶盖稍微松动。）

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

当细胞汇合度未超过80%时，将瓶内完全培养液收集至离心管中，保留5ml培养基，于37℃、5%CO2孵箱内培养；如果细胞密度超过80%，即可进行传代培养，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱内消化1-2分钟，若细胞大部分变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶，加入5ml以上完全培养基结束消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，转移悬液至15ml离心管，1000RPM条件下离心5分钟，弃上清液后补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，然后轻吹使细胞脱落，转移至15ml离心管，1000rpm离心5分钟。
3. 弃上清，加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱；如需转入液氮罐，请在-80℃冰箱存放24小时以上后再转入。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速置于37℃水浴中解冻，确保冻存管中无结晶后，用75%酒精擦拭管外壁。
2. 将冻存管内细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃上清后，重悬于5ml完全培养基，并接种至T25培养瓶，放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基，继续培养。

四、注意事项

某些细胞贴壁不牢，可能在运输过程中发生脱落，这是正常现象。若脱离细胞较多，可将培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清以作过渡培养。沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基，终止反应。再离心，弃上清，重悬于1-2ml完全培养基。按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充完全培养基至5-8ml/瓶，并放入37℃、5%CO2细胞培养箱中。

五、售后条款

1）细胞出现问题，可重发的情况及判定标准：

1. 细胞在运输过程中出现丢失、瓶身破损、严重漏液等问题，可重发。
2. 细胞污染问题：收到产品后48小时内提供真实实验结果，核实后可重发。
3. 常温发货的细胞静置24小时后，或干冰运输细胞复苏后24小时内，若大多数细胞未存活需提供真实清晰的细胞状态照片方可重发。
4. 干冰运输细胞复苏24小时后或常温发货的细胞静置4小时内并未开封时出现污染，重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后重发。
6. 收到细胞当天以及第二、第三天拍照，若3天未告知则视为产品合格。4-7天内出现问题需提供前三天照片、问题出现时照片及相关操作详细步骤，且与技术人员沟通，由其判定责任，重发或按合同50%费用重发。

2）细胞出现问题，不予重发的情况：

1. 客户造成的细胞污染，不重发。
2. 客户不当操作导致细胞状态不佳，不重发。
3. 非我司推荐的培养体系造成细胞状态不佳，不重发。
4. 细胞状态不佳且未提供前三天照片的，不重发。
5. 细胞培养经其他处理的，不重发。
6. 细胞收到2天内未告知的，不重发。
7. 具体情况视情况而定。