尊龙凯时的赭曲霉毒素检测试剂盒（酶联免疫法）说明书

1. 原理及用途

赭曲霉毒素是由曲霉菌属和青霉菌属的某些种类产生的二级代谢产物。其中，赭曲霉毒素A在自然界中分布广泛，毒性尤为强烈，对人类和动植物的影响显著。本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，专门用于检测米面、花生、大豆等谷物及饲料样本中的赭曲霉毒素（Ochratoxins A，OTA）。该试剂盒包括预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂。在检测过程中，标准品或样品溶液被加入，样本中的赭曲霉毒素与酶标板上的偶联抗原竞争结合抗赭曲霉毒素抗体。随后加入酶标记物，通过TMB底物显色，样本的吸光度值与其中赭曲霉毒素的含量呈负相关，由标准曲线进行比对，即可得出样本中赭曲霉毒素的残留量。

2. 技术指标

2.1 灵敏度：1 ppb (ng/ml)

2.2 反应模式：37℃，30分钟 + 30分钟 + 15分钟

2.3 检测下限：谷物 5 ppb；饲料 10 ppb

2.4 交叉反应率：赭曲霉毒素A 100%

2.5 样本回收率：谷物及配合饲料 85% ± 15%

3. 试剂盒组成

本试剂盒包含以下组件：

• 酶标板（96孔）
• 标准品（黑盖）：各1ml，浓度分别为0 ppb、1 ppb、3 ppb、9 ppb、27 ppb、81 ppb
• 酶标记物（红盖） 11 ml
• 抗体工作液（蓝盖） 55 ml
• 底物液A（白盖） 6 ml
• 底物液B（黑盖） 6 ml
• 终止液（黄盖） 6 ml
• 20×浓缩洗涤液（白盖） 40 ml
• 说明书 1份
• 盖板膜 1张
• 自封袋 1个

4. 必要器材和试剂

4.1 仪器

酶标仪、打印机、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器

单道20µl-200µl，100µl-1000µl，多道300µl

5. 样本前处理

5.1 样本处理前须知

实验器具需保持清洁，并使用一次性吸头，以防止污染及干扰实验结果。

5.2 配液

配液1：70%甲醇（V甲醇:V水 = 7:3）。配液2：1M碳酸氢钠溶液（称取42g碳酸氢钠，加去离子水溶解，定容至500ml）。配液3：工作洗涤液（20倍稀释）。

5.3 样本前处理步骤

食品类谷物及大豆类（如大米、玉米、小米等）处理：1）称取4g样品于50ml离心管中，加入10ml 70%甲醇，振荡5分钟，室温下4000转/分离心10分钟；2）取1ml上清，加入1ml 1M碳酸氢钠溶液，振荡；3）取50μl进行分析，样本稀释倍数为5，检测下限为5 ppb。

饲料处理方法：1）称取2g样品于50ml离心管中，加入10ml 70%甲醇，振荡5分钟，室温下4000转/分离心10分钟；2）取1ml上清，加入1ml 1M碳酸氢钠溶液，振荡；3）取50μl进行分析，样本稀释倍数为10，检测下限为10 ppb。

6. 酶联免疫实验步骤

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30分钟以上。洗涤液如在冷藏时有结晶，需恢复到室温以充分溶解。每种液体试剂使用前需摇匀。取出所需数量的微孔板及框架，将未用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 编号

将样本和标准品对应的微孔按序编号，每个样本和标准品各做2孔平行，并记录标准孔和样本孔的位置。

6.2 加样反应

将标准品或样本50µl加入各自的微孔中，加入抗体工作液50µl，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光反应30分钟。

6.3 洗涤

小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350µl工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后用吸水纸轻拍干（未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 加酶反应

加入酶标记物100µl，每孔37℃避光反应30分钟。

6.5 再次洗涤

同上。

6.6 显色

加入底物液A50µl，再加底物液B50µl，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光显色15分钟（若颜色过浅，可适当延长反应时间）。

6.7 终止

加入终止液50µl，轻轻振荡均匀，终止反应。

6.8 测吸光值

使用酶标仪在450nm处测定每孔的吸光度值（建议使用双波长450/630nm），测定应在终止反应后10分钟内完成。

7. 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的吸光度值的平均值（双孔平均）除以第一个标准液（0 ppb）吸光度值，再乘以100%。公式为：百分吸光度值（%）= A × 100% / A0，其中A为标准溶液或样本的平均吸光度值，A0为0 ppb标准溶液的平均吸光度值。

7.2 标准曲线的绘制与计算

以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。从标准曲线中读取样本的百分吸光率对应浓度，乘以其稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。如使用试剂盒专业分析软件进行计算，将更便于大量样本的快速和准确分析。

8. 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本未回到室温（25℃）会导致标准OD值偏低。

8.2 洗板过程中如出现孔干燥，可能导致标准曲线非线性，重复性变差，因此需迅速进行下一步操作。

8.3 为确保ELISA分析的再现性，混合要均匀，洗板要彻底。

8.4 在所有孵育过程中，需用盖板膜封住微孔板，以避免光照影响。

8.5 请勿使用过期试剂盒或混用不同批次的试剂。

8.6 显色液如有变色，需立即弃置；标准吸光度值低于0.5个单位（A450nm<0.5）时，表示可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，请避免皮肤接触。

9. 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒应于2-8℃保存，避免冷冻。保质期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。