中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是中性粒细胞在抵御宿主感染中起到的重要作用。中性粒细胞被视为免疫系统的“先遣部队”，其主要作战手段包括：吞噬、脱颗粒和中性粒细胞胞外陷阱的形成。正如其名称所示，NETs由DNA与蛋白质交织而成，形成了一张可以捕获周围微生物病原体的网络。NETs的形成是中性粒细胞经历了一种独特的细胞死亡方式，被称为NETosis，这是一种不同于凋亡和坏死的炎性细胞死亡方式，表现为核膜破裂、染色质去凝集，以及细胞核、细胞质与颗粒成分的混合。

在流式细胞技术方面，来自惠灵顿奥塔哥大学和维多利亚大学的合作团队开发了一种基于全光谱流式细胞术的NETs检测方案。从人的外周血中分离粒细胞，结合中性粒细胞附着的胞外DNA（7-AAD+）和多种NET相关的颗粒蛋白（如MPO、NE和H3cit）来识别NETs。同时，他们有效地区分了NETosis（Zombie NIR dim 7-AAD+）与坏死（Zombie NIR+ 7-AAD+）细胞的状态。这一方案的创新之处在于使用了3激光配置的Cytek® Aurora™全光谱分析型流式细胞仪，从溢出扩散矩阵（SSM）的结果中可以看出，荧光组合之间的干扰非常小，表明Cytek流式细胞仪在小规模方案的检测中具有卓越性能和更高的数据质量。

在实验中，研究人员通过体外模拟条件，使用不同浓度的PMA刺激分离得到的粒细胞以诱导NETs的形成。对髓过氧化物酶（MPO）活性与Zombie NIR阴性率的比较结果显示，适宜的PMA浓度范围为19-133nM。染色后的粒细胞使用Cytek Aurora全光谱分析型流式细胞仪进行数据采集和分析。首先，通过圈选SSC-A hi FSC-A hi以排除黏连体，随后依次检测CD66b、CD15和CD16的表达丰度，其中CD16在PMA刺激后会从中性粒细胞表面脱落，而CD66b和CD15能同时识别静息状态及PMA、离子霉素和FSL-1激活状态下的中性粒细胞，因此最终选择CD66b+CD15+作为中性粒细胞的标志。在NETs细胞表面，附着有DNA，研究人员基于Zombie NIR dim 7-AAD+进行分辨，能够有效区分NETs和DMSO处理组的坏死细胞表型Zombie NIR+ 7-AAD+。

利用髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和瓜氨酸组蛋白H3（H3cit），研究人员进一步精细化圈选NET+中性粒细胞。经过DNase I处理后，NET+中性粒细胞的比例明显降低，从而证明该方案能够特异性识别胞外DNA。

在炎症状态下，全光谱流式检测方案能够成功识别NET+中性粒细胞。为了验证这一方案在实际临床对应的有效性，研究人员对稳定性冠心病（Stable CAD，慢性炎症）与急性心肌梗死（AMI，急性炎症）患者外周血样本进行了比较，结果表明，AMI患者体内的NET+中性粒细胞显著高于稳定性CAD患者。

总结而言，本文构建了基于3激光Cytek® Aurora™全光谱分析型流式细胞仪的新型检测平台，显著提高了NETs量化检测的特异性和准确性。通过CD66b+CD15+识别中性粒细胞，并利用下述特征精准锁定NET+中性粒细胞：（1）NETs表面的DNA，表现为7-AAD+；（2）结合细胞活性染料以区分NET+（Zombie NIR dim）和坏死（Zombie NIR+）中性粒细胞；（3）NETs表达的中性粒细胞相关蛋白如MPO和NE；（4）H3cit标记特定由精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）诱导的NETosis。该方案将在急性炎症患者中评估NET+中性粒细胞的累积，显示出极大的临床应用潜力。与此同时，基于全光谱流式技术，还有很大的扩展空间，例如加入凋亡检测指标如Annexin V，以便在同一方案中同时识别NET+、坏死与凋亡状态的中性粒细胞。此外，其他细胞类型，如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等也显示出细胞外陷阱的形成，可考虑将其指标纳入方案中，以探索更多维度的应用。